Наш портал продолжает совместный проект с компанией FutureBioteh: цикл интервью с молодыми учёными. Наша сегодняшняя героиня — человек, который успевает бороться с болезнью Паркинсона сразу в трёх лабораториях и одновременно — делать проект, призванный облегчить доступ учёным к актуальной научной информации. Главный редактор портала побеседовал с «благородным рыцарем» современной науки, кандидатом биологических наук Евгенией Коноваловой.
Сила «трёх»
Женя, давай для начала разберёмся с твоей научной работой. Я помню, что есть три лаборатории, в которых у тебя есть аффилиация. Что это за лаборатории, и как ты туда попала?
Я закончила биологический факультет МГУ, кафедру физиологии человека и животных, но диплом делала на кафедре биохимии у Александра Болдырева, это был выдающийся учёный, ставший в 2004 году человеком года в Америке. Под его руководством я делала и диссертацию. Когда я защитила диссертацию в Научном центре неврологии, то не знала, чем мне заниматься дальше, была в свободном плавании, потому что тогда исследование закончилось, а новые возможности ещё не появились.
В этот момент заместитель директора по научной работе Сергей Николаевич Иллариошкин, очень известный врач-невролог, учёный, получил грант РНФ по изучению молекулярных механизмов болезни Паркинсона. Он пришёл к нам в лабораторию клинической и экспериментальной нейрохимии со своим партнёром Игорем Анатольевичем Гривенниковым из Института молекулярной генетики и предложил поработать над этим проектом. Я, конечно же, с радостью согласилась, потому что видела в этом новую возможность для получения знаний, которых у меня до этого момента не было. Сказала, что могу и хочу, и через пару недель началась моя стажировка в лаборатории молекулярной генетики соматических клеток.
У них уже была поставлена технология получения и выращивания стволовых клеток, и два-три месяца я училась. После обучения я уже самостоятельно начала ставить эксперименты, проверять различные гипотезы, и в конце первого года у нас появилась красивая публикация в русскоязычном цитируемом журнале.
Меня очень сильно увлёк процесс работы, потому что за этот год я прочитала огромное количество различной литературы, научилась работать с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК), хотя до этого умела лишь пересевать и культивировать довольно простые культуры, разобралась в новой для меня области и поняла, что мне интересно заниматься этим дальше.
Во время второго года работы по гранту я познакомилась в МФТИ с Павлом Волчковым. Это молодой, но уже известный учёный, который работал в Америке в Гарварде, у него есть несколько публикаций в Science, а занимается он коррекцией генетических мутаций. С ним мы тоже стали сотрудничать, и в итоге сейчас часть работы полностью выполняется на базе его лаборатории в биофармкластере. Это и есть третья лаборатория, в которой я работаю.
А о чём была твоя кандидатская диссертация?
Эта история была об активных формах кислорода и карнозине, который мы упаковали в нанолипосомы, чтобы защитить от действия ферментов, его разрушающих, и, тем самым, снизить дозу применяемого препарата. Также мы оценивали его воздействие на клетки феохромоцитомы, дифференцированной по нейрональному типу, которые подвергали окислительному повреждению. Это была очень хорошая модель для изучения возможностей коррекции ишемии и нейродегенерации, которые всегда сопровождаются развитием окислительного стресса в клетках.
Полная персонализация: собственные нейроны в пробирке
В чём смысл того, чем вы занимаетесь сейчас?
Смысл такой: при болезни Паркинсона погибает очень много дофаминергических нейронов. Проблема, с которой сталкиваются врачи, заключается в том, что заболевание выявляется на достаточно поздней стадии, когда 80 процентов клеток уже погибло, т.к. организм обладает огромной возможностью к адаптации и маскирует эти повреждения. Таким образом, коррекция препаратами, как это делается сейчас повсеместно – способ хороший, но придумать, как заместить ущерб, нанесённый заболеванием, нужно. Если мы берём очень маленький лоскут кожи пациента, выращиваем из него культуру фибробластов, затем с помощью вирусов репрограммируем клетки и получаем ИПСК, которые затем дифференцируем в нейроны, то мы получаем огромное количество возможностей того, как помочь пациенту. Например, мы можем протестировать лекарства на культурах его собственных нейронов, выращенных в чашках Петри. Только задумайтесь! Это та самая персонифицированная медицина, о которой так много сейчас говорят. Операции по пересадке уже проводились в мире, и учёные ищут способы, как их усовершенствовать. А это как раз один из методов, который исключает отторжение чужеродной ткани организмом.
Этим мало кто занимается, не так ли?
До недавнего времени это вообще оставалось невозможным. Но первые попытки уже предприняты. Есть, однако, и некоторые сложности. Например, известно, что при некоторых формах болезни Паркинсона в клетках накапливается патологическая модификация альфа-синуклеина. И при пересадке уже новые клетки всё равно продолжают «заражаться» им от соседей. Также важно понимать, что если мы имеем дело с заболеванием, обусловленным генетической мутацией, то фибробласты тоже могут содержать эту мутацию. Сейчас мы сосредоточились именно на проблеме мутаций. Мы хотим делать коррекцию в клетке, в фибробласте, либо в стволовых клетках, и уже после этого их пересаживать.
Основное место, где повреждается основное количество нейронов у больных Паркинсоном и куда нужно пересаживать клетки, — это чёрная субстанция, верно?
В основном, да.
Но там же проблема не в том, чтобы взять нейроны и пересадить на место погибших. Всё решают не сами нервные клетки, а ещё и окружение, их соединения, как говорят — коннектом. Возможно ли решать эту проблему?
В принципе, возможно. Во-первых, я надеюсь пересаживать не только дофаминергические клетки, а целый органоид — несколько слоёв разных нейрональных клеток (фидер и нейроны). То есть целиком всю эту структуру. Сейчас много нерешённых вопросов, но первые операции уже продемонстрировали эффект, дали какой-тот шанс больным. Люди живут после неё (мы недавно писали о смерти пациента, который прожил с пересаженными нейронами 24 года — прим. ред.). Считается, что даже если человеку операция даёт 5 лет жизни, то это уже результат.
Сколько времени занимает процесс такого выращивания сам по себе? Опиши весь путь, который проходит ещё живущий кусочек кожи до полной пересадки.
Как раз буквально сегодня делали ещё одну биопсию у пациента со спорадической формой болезни Паркинсона.
Что такое спорадическая форма?
Это значит, что она не имеет генетической причины. Либо это какая-то неисследованная мутация, ранее неизвестная, либо с ним произошло что-то непонятное, например, отравился пестицидами и т.п.
Сам процесс выглядит так: мы берём биопсию кожи — маленький кусочек 3х3 мм. Затем аккуратно вырезаем, помещаем в специальную стерильную среду, и после этого ждём примерно две недели до тех пор, пока из него не выйдут клетки. Сначала кератиноциты, а потом уже фибробласты. После этого мы убираем тот лоскут кожи и культивируем отдельно уже фибробласты. Далее берём фибробласты первых пассажей, от первого до третьего, и их обрабатываем вирусами. Есть несколько систем вирусного репрограммирования, мы пробовали две: лентивирусное репрограммирование, когда вирус встраивается в геном клетки. Хотя всё, что связано со встраиванием в ДНК, вызывает длительные дискуссии специалистов в такой области, как онкология.
Слева — фибробласты, справа — выращенные из них нейроны
Второй опробованный нами способ действует через неинтегрирующий вирус Сендай, который действует на уровне РНК. Он просто запускает некоторые процессы, и дальше клетки уже индуцированы на редифференцировку в плюрипотентные стволовые клетки.
Скажем, первый способ, с лентивирусом, хорош, колонии клеток получаются стабильные, но неизвестно, что будет дальше с этим геномом. С вирусом Сендай мы исключаем такую возможность, но получение колоний этих стволовых клеток осложнено. Они менее стабильны.
Фибробласты растут две недели, ещё две недели проходит после репрограммирования вирусами, и ещё дней десять — до образования первых колоний. Мы рассаживаем их и наращиваем. Их может быть очень много. То есть, из одной линии фибробластов мы получаем порядка ста колоний, их отбираем, и, в итоге, жизнеспособными оказываются штук пять из ста. Дальше — тестируем. Должно пройти порядка двух месяцев, прежде чем мы отберём колонию стволовых клеток, с которой будем дальше работать.
После этого мы дифференцируем стволовые клетки в нейроны. Есть несколько стадий: стадия нервного гребня, нейрональных розеток, дальше стадия нейросфер, из которых после созревания мы получаем первичные нейроны или нейрональные предшественники, а дальше ещё месяц они растут до дифференцированных дофаминергических нейронов. Процесс всех метаморфозов от стволовых клеток до дофаминергических нейронов занимает порядка двух с половиной месяцев.
Потенциальная «доклиника» в действии
А вы пользуетесь только одной методикой?
На самом деле мы отработали разные методики. Сначала мы взяли ту, которую предложил нобелевский лауреат Яманака в 2006 году. У нас получилось вырастить дофаминергические нейроны и охарактеризовать их по нескольким критериям: например, выявили экспрессию дофаминергического транспортёра на уровнях мРНК и белковом, измерили работу этого транспортёра с применением конкурентного ингибирования флуоресцирующим веществом ASP, который представляет собой аналог дофамина.
Мы планируем дальше пересаживать нейроны крысам, и есть идея, что хорошо бы сделать животную «модель», которая будет нести мутацию, аналогичную той, которую мы изучаем у наших пациентах.
Скажем, у нас есть несколько линий стволовых клеток с мутацией в гене PARK2. Человеческий ген имеет 12 экзонов, а у наших пациентов встречается дупликация (удвоение) экзона или делеция (потеря) экзона. Есть ещё один вариант, у которого в одном аллеле точечная мутация, а в другом — инверсия, то есть буквы поменялись местами. Мы думаем, что какую-то из них возьмём и попробуем повторить на животных, чтобы дальше изучать действия лекарств и смотреть, как работает трансплантация.
То есть вот эта культура, которая в итоге получается, может ещё и быть моделью для «предклиники» лекарств?
Именно! На самом деле это и есть основная цель. В нашей лаборатории клетки высаживаются на мультиэлектродную матрицу. Это такое стекло с подведёнными с одной стороны микроэлектродами, а с другой стороны находится ванночка объёмом 1 мл, в которую мы вносим нейрональную суспензию в объёме 30 мкл жидкости. Клетки там распластываются, выпускают аксоны, образуют связи. В итоге мы можем в эту систему добавить какое-то лекарство и для конкретного пациента посмотреть, каков будет ответ его собственных нейронов: допустим, есть ли у них спонтанная активность, то есть, передают ли они электрический сигнал.
Тогда следующий вопрос, хотя, возможно, он покажется странным. Не так давно мы брали интервью у Виктории Коржовой, которая работает в Мюнхене и занимается болезнью Альцгеймера. И пока всё то, чем она занимается, привело её группу в серьёзный тупик по всем путям, которые они прошли. Вот как у вас обстоят дела? Есть какие-то перспективы именно не в поддержке трансплантации, а в полном излечении от болезни?
Фактически, мы только начали, и, безусловно, у нас есть идеи, как это развивать дальше. Единственная проблема в том, что заканчивается грант, и мы хотели бы его продлить.
Вообще в литературе описано, что делают пересадки крысам по другой методике, когда берут стволовые клетки и клетки-нейроны, делают из них суспензию и только потом – пересаживают. И они, таким образом, гораздо лучше приживаются. А мы бы, во-первых, хотели попробовать совмещать это с нано-технологиями, использовать скаффолды (трёхмерные матрицы для роста ткани — прим.ред.), которые помогают клеткам правильно ориентироваться в пространстве. Во-вторых, добавлять в них факторы роста клеток и брать суспензию, состоящую не из терминальных дифференцированных нейронов, а из тех, которые находятся в состоянии предшественников и ранней нейрональной дифференцировки. Может быть, сочетание вот этих трёх вещей и приведёт к какому-то новому результату.
То есть, у тебя планы на много лет вперёд?
У меня да, здесь ещё работать и работать.
Не возникало ли желание уйти из науки?
Каждый день открывается что-то новое. Может быть, через пять лет вообще появится что-то совсем другое. Скажем, несколько лет назад никто не знал про CRISPR/CAS9 — супер-изобретение, помогающее редактировать геном. Были другие способы, а этот стал прорывом. Когда-то придумали ПЦР, с помощью которой появилась возможность анализировать геном. А сейчас вообще эра прорывных технологий. Сейчас как раз пришло время науки.
«Робин Гуд» современности: во имя науки и прогресса
Но ведь ты же занимаешься не только наукой в чистом виде? Расскажи о своём личном проекте.
Эта идея пока сырая, она возникла где-то месяц или полтора месяца назад. У меня были довольно пессимистичные мысли, и я думала: как же так, в связи с такой экономической ситуацией люди не могут позволить себе ездить на конференцию, как раньше. Например, я ездила 2 раза в год. Сейчас, если и поеду раз в год или раз в два года, это будет уже хорошо. Значит, о научных новостях стало возможным узнавать только из публикаций. А статьи покупать дорого. С отечественными публикациями тоже есть проблема — не все хорошо цитируются, но для отчёта по гранту нужно достаточно большое их количество в год. Если учесть, что рецензия на одну статью в иностранный журнал занимает иногда до полугода, то нужно выбирать, что публиковать в отечественных журналах, быстро, а что оставлять на потом, дорабатывать. И, конечно же, я хотела бы, чтобы индекс цитируемости тех журналов, в которых бы я публиковалась, был высокий. Это логично, если речь идёт о карьере учёного.
Поэтому я подумала, чего не хватает, так сказать, для полного счастья, и решила, что, было бы здорово иметь приложение, которое присылало бы push-уведомления по каким-то актуальным публикациям (например, сегодня кто-то опубликовал статью про дофаминергические нейроны, полученные из ИПСК). А дальше я, к примеру, открываю сообщение и понимаю, что это лаборатория, которую я ещё не знаю, но которая уже может стать моим конкурентом. Я вообще слежу за публикациями тех лабораторий, которые работают в одной тематике со мной, но могу не заметить каких-то новых.
Я поспрашивала у своих коллег, интересно ли им было бы иметь такое приложение, и они ответили, что да, даже многое посоветовали. Как-то быстро вокруг меня образовалась команда людей, которые тоже хотят развивать науку в России, горят этой идеей, хотят, чтобы публикаций у нас было намного больше, чтобы мы были в курсе всех новостей.
С этой идеей я пришла в бизнес-инкубатор Высшей школы экономики, а это один из лучших игроков на поле стартапов. У них было несколько заданий: во-первых, описать свою идею, ответить на массу вопросов, рассказать про проект. В итоге по формальным критериям идея им подошла. Дальше был следующий тур, когда эксперты, бизнесмены и основатели НИУ ВШЭ оценивали мой проект, и им тоже понравилась моя презентация. Меня пригласили на финальную сессию, которая прошла неделю назад. К тому моменту из большого числа участников осталось всего 18, а на последнем этапе — всего 8. И среди них — мой проект Science guide. Сейчас пока что есть только страница в фейсбуке, где мы собираем научные новости, а также рассылаем их нашим подписчикам.
В инкубаторе нас учат правильно ставить гипотезы, вести lean startup, что значит «клиентоориентированный стартап», дословно — помогать решить проблему, которая сложилась у клиентов — в нашем случае, у учёных. Я провела огромное количество проблемных интервью, онлайн-опросов, анализов различных метрик для того, чтобы выяснить, что у них «болит», как они решают эту проблему, что их не устраивает в этом решении и так далее. Каждую неделю у нас в коворкинге проходят питчи, где тренеры оценивают скорость роста команд, а эксперты оценивают идеи. Всё очень насыщенно и интересно.
В итоге я в течение трёх месяцев должна сделать прототип, его обкатать, выявить плюсы и минусы и развивать дальше. И НИУ ВШЭ помогает тем, что строит какую-то систему в голове людей: как делать бизнес, откуда брать инвестиции, что должно быть, какая должна быть бизнес-модель, они сопровождают проект от идеи до масштабирования. Мы, учёные, довольно оторванные от реальности люди. Это правда! И я не вижу в этом ничего плохого, кто-то должен мечтать, а кто-то — воплощать. Есть художники, а есть писатели, есть математики. Это хорошо, что мы все разные. И я решила научиться применять свои исследования для того, чтобы они приносили пользу людям уже сейчас.
То, что и называется инновацией?
Можно и так сказать.
Беседовал Алексей Паевский